原位雜交探針的設計與合成，核心是根據實驗目標選擇合適的探針類型，并通過體外轉錄等方法制備標記探針。針對不同的應用場景（如組織切片、細胞樣本或染色體標本），具體流程會有所差異。
目前主要有三種探針方案：RNA探針、DNA探針、寡核苷酸探針。

無論選擇哪種探針，設計時都應遵循以下原則以確保實驗成功：

長度控制：RNA探針用于雜交時建議150-200個堿基，過長需堿水解以提高組織滲透性；模板質粒長度最好不超過1.5 k。-

• 特異性：探針序列應與靶標RNA高度互補，與其他基因無明顯匹配，通常GC含量控制在40%-60%-。

• 方向確認：用于檢測的反義探針與靶標互補；做陰性對照的正義探針與靶標序列相同-。

??? 以RNA探針為例的通用合成流程

這是實驗室常用的方法之一，尤其是制備（DIG）標記的探針-。

1. 前期準備：獲取模板

模板擴增：通過PCR擴增或質粒擴增獲取包含目標序列的DNA片段-。

載體克隆：將該片段克隆至含SP6、T7或T3啟動子的專用載體（如pGEM-T）上。

2. 核心步驟：質粒線性化

酶切：選擇合適的限制性內切酶，在目標序列的下游將環狀質粒切開，得到線性的DNA模板，這能確保轉錄在目標序列處終止-。

純化：通過酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除酶和雜質，得到純凈的模板-。

3. 關鍵步驟：體外轉錄與標記

體系配置：在無RNase的離心管中混合線性化模板、RNA聚合酶、緩沖液和DIG-RNA標記混合液（含DIG標記的UTP）。

• 反應：37℃孵育約2小時，RNA聚合酶會以DNA為模板合成大量摻入DIG標記的RNA探針-。

4. 后處理：純化與水解

去除模板：加入無RNase的DNase I，消化掉作為模板的DNA-。

探針水解：若探針過長，需在60℃用碳酸鹽緩沖液水解至理想長度，然后通過乙醇沉淀濃縮回收-。